Testovanie metylácie DNA v kombinácii so smartfónmi pre včasný skríning nádorov a leukémie s presnosťou 90,0 %!

Včasná detekcia rakoviny na základe tekutej biopsie je nový smer detekcie a diagnostiky rakoviny, ktorý v posledných rokoch navrhol americký Národný onkologický inštitút s cieľom odhaliť včasnú rakovinu alebo dokonca prekancerózne lézie. Široko sa používa ako nový biomarker na včasnú diagnostiku rôznych malignít vrátane rakoviny pľúc, gastrointestinálnych nádorov, gliómov a gynekologických nádorov.

Vznik platforiem na identifikáciu biomarkerov metylačnej krajiny (Methylscape) má potenciál výrazne zlepšiť existujúci včasný skríning rakoviny a umiestniť pacientov do najskoršieho liečiteľného štádia.

Výskumníci nedávno vyvinuli jednoduchú a priamu senzorickú platformu na detekciu metylačnej krajiny založenú na zlatých nanočasticiach dekorovaných cysteamínom (Cyst/AuNP) v kombinácii s biosenzorom na báze smartfónu, ktorá umožňuje rýchly včasný skríning širokej škály nádorov. Včasný skríning leukémie je možné vykonať do 15 minút po extrakcii DNA zo vzorky krvi s presnosťou 90,0 %. Názov článku je Rýchla detekcia rakovinovej DNA v ľudskej krvi pomocou AuNP s cysteamínovou vrstvou a smartfónu s podporou strojového učenia.

Obrázok 1. Jednoduchá a rýchla snímacia platforma na skríning rakoviny prostredníctvom komponentov Cyst/AuNP sa dá vytvoriť v dvoch jednoduchých krokoch.

Toto je znázornené na obrázku 1. Najprv sa na rozpustenie fragmentov DNA použil vodný roztok. Do zmiešaného roztoku sa potom pridali Cyst/AuNP. Normálna a malígna DNA majú odlišné metylačné vlastnosti, čo vedie k fragmentom DNA s rôznymi vzormi samoskladania. Normálna DNA sa voľne agreguje a nakoniec agreguje Cyst/AuNP, čo má za následok červený posun Cyst/AuNP, takže voľným okom je možné pozorovať zmenu farby z červenej na fialovú. Naproti tomu jedinečný metylačný profil rakovinovej DNA vedie k produkcii väčších zhlukov fragmentov DNA.

Snímky 96-jamkových platní boli zhotovené pomocou fotoaparátu smartfónu. Rakovinová DNA bola meraná smartfónom vybaveným strojovým učením v porovnaní s metódami založenými na spektroskopii.

Skríning rakoviny v reálnych vzorkách krvi

Aby sa rozšírila využiteľnosť senzorickej platformy, výskumníci použili senzor, ktorý úspešne rozlišoval medzi normálnou a rakovinovou DNA v reálnych vzorkách krvi. Metylačné vzorce v miestach CpG epigeneticky regulujú génovú expresiu. Takmer vo všetkých typoch rakoviny sa pozorovali striedavé zmeny v metylácii DNA, a teda aj v expresii génov, ktoré podporujú tumorigenézu.

Ako model pre iné druhy rakoviny spojené s metyláciou DNA použili výskumníci vzorky krvi od pacientov s leukémiou a zdravých kontrolných jedincov na skúmanie účinnosti metylačnej krajiny pri diferenciácii leukemických druhov rakoviny. Tento biomarker metylačnej krajiny nielenže prekonáva existujúce metódy rýchleho skríningu leukémie, ale tiež demonštruje uskutočniteľnosť rozšírenia na včasnú detekciu širokej škály druhov rakoviny pomocou tohto jednoduchého a priamočiareho testu.

Analyzovala sa DNA z krvných vzoriek od 31 pacientov s leukémiou a 12 zdravých jedincov. Ako je znázornené v rámčekovom grafe na obrázku 2a, relatívna absorbancia vzoriek rakoviny (ΔA650/525) bola nižšia ako u DNA z normálnych vzoriek. Bolo to spôsobené najmä zvýšenou hydrofóbnosťou, ktorá viedla k hustej agregácii rakovinovej DNA, čo zabránilo agregácii Cyst/AuNP. V dôsledku toho boli tieto nanočastice úplne dispergované vo vonkajších vrstvách rakovinových agregátov, čo viedlo k odlišnej disperzii Cyst/AuNP adsorbovaných na normálnych a rakovinových agregátoch DNA. ROC krivky boli potom vygenerované zmenou prahovej hodnoty od minimálnej hodnoty ΔA650/525 po maximálnu hodnotu.

Obrázok 2.(a) Relatívne hodnoty absorbancie roztokov cýst/AuNP ukazujúce prítomnosť normálnej (modrá) a rakovinovej (červená) DNA za optimalizovaných podmienok

(DA650/525) krabicových grafov; (b) ROC analýza a hodnotenie diagnostických testov. (c) Matica zmätenosti pre diagnostiku zdravých a onkologických pacientov. (d) Citlivosť, špecificita, pozitívna prediktívna hodnota (PPV), negatívna prediktívna hodnota (NPV) a presnosť vyvinutej metódy.

Ako je znázornené na obrázku 2b, plocha pod ROC krivkou (AUC = 0,9274) získaná pre vyvinutý senzor vykazovala vysokú citlivosť a špecificitu. Ako je možné vidieť z krabicového grafu, najnižší bod predstavujúci normálnu skupinu DNA nie je dobre oddelený od najvyššieho bodu predstavujúceho skupinu rakovinovej DNA; preto sa na rozlíšenie medzi normálnou a rakovinovou skupinou použila logistická regresia. Pri danej sade nezávislých premenných sa odhaduje pravdepodobnosť výskytu udalosti, ako je rakovina alebo normálna skupina. Závislá premenná sa pohybuje medzi 0 a 1. Výsledkom je teda pravdepodobnosť. Pravdepodobnosť identifikácie rakoviny (P) sme určili na základe ΔA650/525 nasledovne.

kde b=5,3533,w1=-6,965. Pri klasifikácii vzorky pravdepodobnosť menšia ako 0,5 označuje normálnu vzorku, zatiaľ čo pravdepodobnosť 0,5 alebo vyššia označuje vzorku s rakovinou. Obrázok 2c znázorňuje maticu zmätku vygenerovanú krížovou validáciou metódy „leave-it-alone“, ktorá bola použitá na overenie stability klasifikačnej metódy. Obrázok 2d sumarizuje hodnotenie diagnostického testu metódy vrátane citlivosti, špecifickosti, pozitívnej prediktívnej hodnoty (PPV) a negatívnej prediktívnej hodnoty (NPV).

Biosenzory založené na smartfónoch

Aby sa testovanie vzoriek ešte viac zjednodušilo bez použitia spektrofotometrov, výskumníci použili umelú inteligenciu (AI) na interpretáciu farby roztoku a rozlíšenie medzi normálnymi a rakovinovými jedincami. Vzhľadom na to sa na preklad farby roztoku Cyst/AuNPs na normálnu DNA (fialová) alebo rakovinovú DNA (červená) pomocou snímok 96-jamkových platní zhotovených fotoaparátom mobilného telefónu použilo počítačové videnie. Umelá inteligencia môže znížiť náklady a zlepšiť dostupnosť pri interpretácii farby roztokov nanočastíc, a to bez použitia akéhokoľvek optického hardvérového príslušenstva smartfónov. Nakoniec boli na zostavenie modelov natrénované dva modely strojového učenia, vrátane Random Forest (RF) a Support Vector Machine (SVM). Modely RF aj SVM správne klasifikovali vzorky ako pozitívne a negatívne s presnosťou 90,0 %. To naznačuje, že použitie umelej inteligencie v biosenzoroch založených na mobilných telefónoch je celkom možné.

Obrázok 3.(a) Cieľová trieda roztoku zaznamenaná počas prípravy vzorky pre krok snímania obrazu. (b) Príklad obrazu zhotoveného počas kroku snímania obrazu. (c) Intenzita farby roztoku cysty/AuNP v každej jamke 96-jamkovej platne extrahovanej zo obrazu (b).

Pomocou Cyst/AuNP sa výskumníkom úspešne podarilo vyvinuli jednoduchú senzorickú platformu na detekciu metylačnej krajiny a senzor schopný rozlíšiť normálnu DNA od rakovinovej DNA pri použití skutočných vzoriek krvi na skríning leukémie. Vyvinutý senzor preukázal, že DNA extrahovaná zo skutočných vzoriek krvi dokázala rýchlo a nákladovo efektívne detegovať malé množstvá rakovinovej DNA (3 nM) u pacientov s leukémiou za 15 minút a vykazovala presnosť 95,3 %. Na ďalšie zjednodušenie testovania vzoriek elimináciou potreby spektrofotometra sa na interpretáciu farby roztoku a rozlíšenie medzi normálnymi a rakovinovými jedincami pomocou fotografie z mobilného telefónu použilo strojové učenie s presnosťou 90,0 %.

Odkaz: DOI: 10.1039/d2ra05725e