Interferenčné faktory v PCR reakciách

Počas PCR reakcie sa často vyskytujú niektoré rušivé faktory.
Vzhľadom na veľmi vysokú citlivosť PCR sa kontaminácia považuje za jeden z najdôležitejších faktorov ovplyvňujúcich výsledky PCR a môže viesť k falošne pozitívnym výsledkom.
Rovnako dôležité sú rôzne zdroje, ktoré vedú k falošne negatívnym výsledkom. Ak je jedna alebo viacero podstatných častí PCR zmesi alebo samotná amplifikačná reakcia inhibovaná alebo narušená, diagnostický test môže byť spomalený. To môže viesť k zníženej účinnosti a dokonca k falošne negatívnym výsledkom.
Okrem inhibície môže dôjsť k strate integrity cieľovej nukleovej kyseliny v dôsledku podmienok prepravy a/alebo skladovania pred prípravou vzorky. Najmä vysoké teploty alebo nedostatočné skladovanie môžu viesť k poškodeniu buniek a nukleových kyselín. Fixácia buniek a tkanív a zabudovanie do parafínu sú dobre známe príčiny fragmentácie DNA a pretrvávajúci problém (pozri obrázky 1 a 2). V týchto prípadoch nepomôže ani optimálna izolácia a purifikácia.

Obrázok 1 | Vplyv imobilizácie na integritu DNA
Elektroforéza na agarózovom géli ukázala, že kvalita DNA izolovanej z parafínových rezov pitiev sa značne líšila. V extraktoch bola prítomná DNA s rôznymi priemernými dĺžkami fragmentov v závislosti od metódy fixácie. DNA sa zachovala iba pri fixácii v natívnych zmrazených vzorkách a v pufrovanom neutrálnom formalíne. Použitie silne kyslého Bouinového fixatívu alebo nepufrovaného formalínu obsahujúceho kyselinu mravčiu viedlo k významnej strate DNA. Zvyšná frakcia je vysoko fragmentovaná.
Vľavo je dĺžka fragmentov vyjadrená v kilobázových pároch (kbp)

Obrázok 2 | Strata integrity cieľových nukleových kyselín
(a) Medzera 3′-5′ na oboch vláknach bude mať za následok prerušenie cieľovej DNA. Syntéza DNA bude stále prebiehať na malom fragmente. Ak však na fragmente DNA chýba miesto naviazania primerov, dôjde iba k lineárnej amplifikácii. V najpriaznivejšom prípade sa fragmenty môžu navzájom resaturovať, ale výťažky budú malé a pod úrovňou detekcie.
(b) Strata báz, najmä v dôsledku depurinácie a tvorby tymidínového diméru, vedie k zníženiu počtu vodíkových väzieb a zníženiu Tm. Počas predĺženej fázy otepľovania sa priméry roztavia z matricovej DNA a nenavážu sa ani za menej prísnych podmienok.
(c) Susedné tymínové bázy tvoria TT dimér.
Ďalším bežným problémom, ktorý sa často vyskytuje v molekulárnej diagnostike, je menej ako optimálne uvoľňovanie cieľových nukleových kyselín v porovnaní s fenol-chloroformovou extrakciou. V extrémnych prípadoch to môže byť spojené s falošne negatívnymi výsledkami. Veľa času sa dá ušetriť lýzou varom alebo enzymatickým štiepením bunkových zvyškov, ale táto metóda často vedie k nízkej citlivosti PCR v dôsledku nedostatočného uvoľňovania nukleových kyselín.

Inhibícia polymerázovej aktivity počas amplifikácie

Vo všeobecnosti sa inhibícia používa ako súhrnný koncept na opis všetkých faktorov, ktoré vedú k suboptimálnym výsledkom PCR. V striktne biochemickom zmysle je inhibícia obmedzená na aktivitu enzýmu, t. j. znižuje alebo zabraňuje konverzii substrát-produkt prostredníctvom interakcie s aktívnym miestom DNA polymerázy alebo jej kofaktora (napr. Mg2+ pre Taq DNA polymerázu).
Zložky vo vzorke alebo rôzne pufre a extrakty obsahujúce činidlá môžu priamo inhibovať enzým alebo zachytiť jeho kofaktory (napr. EDTA), čím inaktivujú polymerázu a následne vedú k zníženým alebo falošne negatívnym výsledkom PCR.
Mnohé interakcie medzi reakčnými zložkami a nukleovými kyselinami obsahujúcimi cieľ sa však tiež označujú ako „inhibítory PCR“. Keď je integrita bunky narušená izoláciou a nukleová kyselina sa uvoľní, môžu nastať interakcie medzi vzorkou a jej okolitým roztokom a pevnou fázou. Napríklad „lapače“ sa môžu viazať na jednovláknovú alebo dvojvláknovú DNA prostredníctvom nekovalentných interakcií a interferovať s izoláciou a purifikáciou znížením počtu cieľov, ktoré sa nakoniec dostanú do reakčnej nádoby PCR.
Inhibítory PCR sú vo všeobecnosti prítomné vo väčšine telesných tekutín a činidiel používaných na klinické diagnostické testy (močovina v moči, hemoglobín a heparín v krvi), výživových doplnkoch (organické zložky, glykogén, tuk, ióny Ca2+) a zložkách životného prostredia (fenoly, ťažké kovy).

Výskyt inhibítorov PCR sa častejšie vyskytuje v baktériách a eukaryotických bunkách, necieľovej DNA, makromolekulách viažucich DNA v tkanivových matrícach a laboratórnych zariadeniach, ako sú rukavice a plasty. Purifikácia nukleových kyselín počas alebo po extrakcii je preferovanou metódou na odstránenie inhibítorov PCR.
V súčasnosti dokážu rôzne automatizované extrakčné zariadenia nahradiť mnoho manuálnych protokolov, ale 100 % výťažnosť a/alebo purifikácia cieľov sa nikdy nedosiahla. Potenciálne inhibítory môžu byť stále prítomné v purifikovaných nukleových kyselinách alebo už mohli účinkovať. Existujú rôzne stratégie na zníženie vplyvu inhibítorov. Výber vhodnej polymerázy môže mať významný vplyv na aktivitu inhibítora. Ďalšími osvedčenými metódami na zníženie inhibície PCR sú zvýšenie koncentrácie polymerázy alebo aplikácia aditív, ako je BSA.
Inhibíciu PCR reakcií možno preukázať použitím internej kontroly kvality procesu (IPC).
Je potrebné dbať na to, aby sa z izolátu nukleovej kyseliny dôkladným premytím odstránili všetky činidlá a iné roztoky v extrakčnej súprave, ako napríklad etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol a fenol. V závislosti od ich koncentrácie môžu aktivovať alebo inhibovať PCR.