Interferenčné faktory pri reakciách PCR

Počas reakcie PCR sa často vyskytujú niektoré interferujúce faktory.
Kvôli veľmi vysokej citlivosti PCR sa kontaminácia považuje za jeden z najdôležitejších faktorov ovplyvňujúcich výsledky PCR a môže priniesť falošne pozitívne výsledky.
Rovnako kritické sú rôzne zdroje, ktoré vedú k falošne negatívnym výsledkom. Ak sú jedna alebo viac základných častí zmesi PCR alebo samotná amplifikačná reakcia inhibovaná alebo interferovaná, je možné brániť diagnostickému testu. To môže viesť k zníženiu účinnosti a dokonca k falošným negatívnym výsledkom.
Okrem inhibície sa môže pred prípravou vzorky vyskytnúť strata cieľovej integrity nukleových kyselín v dôsledku podmienok prepravy a/alebo skladovania. Najmä vysoké teploty alebo nedostatočné skladovanie môžu viesť k poškodeniu buniek a nukleových kyselín. Fixácia buniek a tkanív a vloženie parafínu sú dobre známe príčiny fragmentácie DNA a pretrvávajúci problém (pozri obrázky 1 a 2). V týchto prípadoch nepomôže ani optimálna izolácia a čistenie.

Obrázok 1 | Účinok imobilizácie na integritu DNA
Elektroforéza agarózového gélu ukázala, že kvalita DNA izolovaná z parafínových rezov pitvy sa značne menila. DNA rôznych priemerných dĺžok fragmentov bola prítomná v extraktoch v závislosti od metódy fixácie. DNA sa zachovala iba vtedy, keď bola fixovaná v natívnych zmrazených vzorkách a v pufrovanom neutrálnom formalíne. Použitie silne kyslého fixačného alebo neviazaného formalínu obsahujúceho kyselinu mravču viedlo k významnej strate DNA. Zostávajúca frakcia je vysoko fragmentovaná.
Vľavo je dĺžka fragmentov vyjadrená v pároch kilobázy (KBP)

Obrázok 2 | Strata integrity cieľov nukleových kyselín
(A) 3'-5 'medzera na oboch vláknach bude mať za následok prerušenie cieľovej DNA. Syntéza DNA sa stále vyskytne na malom fragmente. Ak však na fragmente DNA chýba miesto žíhania priméru, dochádza k iba lineárnej amplifikácii. V najpriaznivejšom prípade sa fragmenty môžu navzájom znovu nasmerovať, ale výnosy budú malé a pod úrovňou detekcie.
(B) Strata báz, hlavne v dôsledku depurácie a tvorby dimérov tymidínu, vedie k zníženiu počtu H-väzieb a zníženiu TM. Počas predĺženej fázy otepľovania sa priméry roztopia od matrice DNA a nebudú žíhať ani za menej prísnych podmienok.
c) susedné tymínové bázy tvoria dimér TT.
Ďalším bežným problémom, ktorý sa často vyskytuje pri molekulárnej diagnostike, je menej ako optimálne uvoľňovanie cieľových nukleových kyselín v porovnaní s extrakciou fenol-chloroform. V extrémnych prípadoch to môže byť spojené s falošnými negatívami. Veľa času sa dá ušetriť varom lýzy alebo enzymatickým trávením zvyškov buniek, ale táto metóda často vedie k nízkej citlivosti PCR v dôsledku nedostatočného uvoľňovania nukleových kyselín.

Inhibícia polymerázovej aktivity počas amplifikácie

Všeobecne sa inhibícia používa ako koncept kontajnera na opis všetkých faktorov, ktoré vedú k suboptimálnym výsledkom PCR. V prísne biochemickom zmysle je inhibícia obmedzená na aktivitu enzýmu, tj redukuje alebo zabraňuje konverzii substrátového produktu prostredníctvom interakcie s aktívnym miestom DNA polymerázy alebo jeho kofaktora (napr. MG2+ pre TAQ DNA polymerázu).
Komponenty vo vzorke alebo rôznych pufrach a extraktoch obsahujúcich činidlá môžu priamo inhibovať enzým alebo zachytiť jeho kofaktory (napr. EDTA), čím inaktivujú polymerázu a následne vedie k zníženiu alebo falošne negatívnym výsledkom PCR.
Mnohé interakcie medzi reakčnými zložkami a nukleovými kyselinami obsahujúcimi cieľ sa však označujú aj ako „inhibítory PCR“. Akonáhle je integrita bunky narušená izoláciou a uvoľňuje sa nukleová kyselina, môže sa vyskytnúť interakcie medzi vzorkou a jej okolitým roztokom a tuhej fázy. Napríklad „vychytávače“ sa môžu viazať jednovrstvou alebo dvojvláknovou DNA prostredníctvom nekovalentných interakcií a interferovať s izoláciou a čistením znížením počtu cieľov, ktoré nakoniec dosiahnu reakčnú nádobu PCR.
Všeobecne sú inhibítory PCR prítomné vo väčšine telesných tekutín a činidiel používaných na klinické diagnostické testy (močovina v moči, hemoglobíne a heparíne v krvi), doplnky výživy (organické zložky, glykogén, tuky, CA2+ ióny) a komponenty v prostredí (fenoly (fenoly , ťažké kovy)

Prevalentnejšie inhibítory PCR sa nachádzajú v baktériách a eukaryotických bunkách, necieľovej DNA, DNA viažucich makromolekulách tkanivových matíc a laboratórnych zariadení, ako sú rukavice a plasty. Čistenie nukleových kyselín počas extrakcie alebo po extrakcii je preferovanou metódou na odstránenie inhibítorov PCR.
Dnes môže rôzne automatizované extrakčné zariadenia nahradiť mnoho manuálnych protokolov, ale 100% regenerácie a/alebo čistenie cieľov sa nikdy nedosiahlo. Potenciálne inhibítory môžu byť stále prítomné v purifikovaných nukleových kyselinách alebo sa už mohli prejaviť. Existujú rôzne stratégie na zníženie vplyvu inhibítorov. Výber vhodnej polymerázy môže mať významný vplyv na aktivitu inhibítora. Ďalšími osvedčenými metódami na zníženie inhibície PCR je zvýšenie koncentrácie polymerázy alebo uplatňovanie prísad, ako je BSA.
Inhibícia reakcií PCR sa môže demonštrovať použitím vnútornej kontroly kvality procesu (IPC).
Musí sa venovať starostlivosti, aby sa odstránili všetky reagencie a iné roztoky v extrakčnej súprave, ako napríklad etanol, EDTA, Cetab, LICL, Guscn, SDS, izopropanol a fenol, z izolátu nukleovej kyseliny dôkladným premytím. V závislosti od ich koncentrácie môžu aktivovať alebo inhibovať PCR.