Interferenčné faktory v PCR reakciách

Počas PCR reakcie sa často stretávame s niektorými interferujúcimi faktormi.
Kvôli veľmi vysokej citlivosti PCR sa kontaminácia považuje za jeden z najdôležitejších faktorov ovplyvňujúcich výsledky PCR a môže viesť k falošne pozitívnym výsledkom.
Rovnako kritické sú rôzne zdroje, ktoré vedú k falošne negatívnym výsledkom. Ak je jedna alebo viac základných častí zmesi PCR alebo samotná amplifikačná reakcia inhibovaná alebo interferovaná, diagnostický test môže byť znemožnený. To môže viesť k zníženiu účinnosti a dokonca k falošne negatívnym výsledkom.
Okrem inhibície môže dôjsť k strate integrity cieľovej nukleovej kyseliny v dôsledku prepravných a/alebo skladovacích podmienok pred prípravou vzorky. Najmä vysoké teploty alebo nevhodné skladovanie môžu viesť k poškodeniu buniek a nukleových kyselín. Fixácia buniek a tkanív a zaliatie parafínom sú dobre známe príčiny fragmentácie DNA a pretrvávajúci problém (pozri obrázky 1 a 2). V týchto prípadoch nepomôže ani optimálna izolácia a čistenie.

Obrázok 1 | Vplyv imobilizácie na integritu DNA
Elektroforéza na agarózovom géli ukázala, že kvalita DNA izolovanej z parafínových rezov pitvy sa značne líšila. V extraktoch bola prítomná DNA rôznych priemerných dĺžok fragmentov v závislosti od spôsobu fixácie. DNA sa zachovala iba vtedy, keď bola fixovaná v natívnych zmrazených vzorkách a v pufrovanom neutrálnom formalíne. Použitie silne kyslého Bouinovho fixačného činidla alebo nepufrovaného formalínu obsahujúceho kyselinu mravčiu viedlo k významnej strate DNA. Zvyšná frakcia je vysoko fragmentovaná.
Vľavo je dĺžka fragmentov vyjadrená v pároch kilobáz (kbp)

Obrázok 2 | Strata integrity cieľových nukleových kyselín
(a) Medzera 3'-5' na oboch vláknach bude mať za následok zlom v cieľovej DNA. syntéza DNA bude stále prebiehať na malom fragmente. Ak však na fragmente DNA chýba miesto na nasadanie priméru, dôjde len k lineárnej amplifikácii. V najpriaznivejšom prípade sa fragmenty môžu navzájom znovu nasýtiť, ale výťažky budú malé a pod úrovňou detekcie.
(b) Strata báz, najmä v dôsledku depurinácie a tvorby tymidínového diméru, vedie k zníženiu počtu H-väzieb a zníženiu Tm. Počas predĺženej fázy zahrievania sa priméry roztavia od matricovej DNA a nebudú anelovať ani za menej prísnych podmienok.
(c) Susedné tymínové bázy tvoria TT dimér.
Ďalším bežným problémom, ktorý sa často vyskytuje v molekulárnej diagnostike, je menej ako optimálne uvoľňovanie cieľových nukleových kyselín v porovnaní s extrakciou fenol-chloroformom. V extrémnych prípadoch to môže byť spojené s falošnými negatívami. Varením alebo enzymatickým štiepením bunkových zvyškov možno ušetriť veľa času, ale táto metóda často vedie k nízkej citlivosti PCR v dôsledku nedostatočného uvoľňovania nukleovej kyseliny.

Inhibícia aktivity polymerázy počas amplifikácie

Vo všeobecnosti sa inhibícia používa ako kontajnerový koncept na opis všetkých faktorov, ktoré vedú k suboptimálnym výsledkom PCR. V striktne biochemickom zmysle je inhibícia obmedzená na aktivitu enzýmu, tj znižuje alebo zabraňuje konverzii substrát-produkt prostredníctvom interakcie s aktívnym miestom DNA polymerázy alebo jej kofaktorom (napr. Mg2+ pre Taq DNA polymerázu).
Zložky vo vzorke alebo rôzne tlmivé roztoky a extrakty obsahujúce reagencie môžu priamo inhibovať enzým alebo zachytávať jeho kofaktory (napr. EDTA), čím inaktivujú polymerázu a následne vedú k zníženým alebo falošne negatívnym výsledkom PCR.
Mnohé interakcie medzi reakčnými zložkami a nukleovými kyselinami obsahujúcimi cieľ sa však označujú aj ako „inhibítory PCR“. Akonáhle je integrita bunky narušená izoláciou a nukleová kyselina je uvoľnená, môžu nastať interakcie medzi vzorkou a jej okolitým roztokom a pevnou fázou. Napríklad „lapače“ môžu viazať jednovláknovú alebo dvojvláknovú DNA prostredníctvom nekovalentných interakcií a interferovať s izoláciou a čistením znížením počtu cieľov, ktoré sa nakoniec dostanú do reakčnej nádoby PCR.
Vo všeobecnosti sú inhibítory PCR prítomné vo väčšine telesných tekutín a činidiel používaných na klinické diagnostické testy (močovina v moči, hemoglobín a heparín v krvi), doplnkoch stravy (organické zložky, glykogén, tuk, Ca2+ ióny) a zložkách životného prostredia (fenoly ťažké kovy)

Prevládajúce inhibítory PCR možno nájsť v baktériách a eukaryotických bunkách, necieľovej DNA, DNA viažucich makromolekulách tkanivových matríc a laboratórnych zariadeniach, ako sú rukavice a plasty. Purifikácia nukleových kyselín počas alebo po extrakcii je preferovanou metódou na odstránenie inhibítorov PCR.
V súčasnosti môžu rôzne automatizované extrakčné zariadenia nahradiť mnohé manuálne protokoly, ale 100% regenerácia a/alebo čistenie cieľov sa nikdy nedosiahlo. Potenciálne inhibítory môžu byť stále prítomné v purifikovaných nukleových kyselinách alebo už môžu pôsobiť. Existujú rôzne stratégie na zníženie účinku inhibítorov. Výber vhodnej polymerázy môže mať významný vplyv na aktivitu inhibítora. Ďalšími overenými metódami na zníženie inhibície PCR sú zvýšenie koncentrácie polymerázy alebo aplikácia aditív, ako je BSA.
Inhibíciu reakcií PCR možno preukázať použitím internej kontroly kvality procesu (IPC).
Je potrebné dbať na to, aby sa z izolátu nukleovej kyseliny dôkladným premytím odstránili všetky činidlá a iné roztoky v extrakčnej súprave, ako je etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol a fenol. V závislosti od ich koncentrácie môžu aktivovať alebo inhibovať PCR.