Vykonávanie štyroch testov amplifikácie nukleových kyselín na identifikáciu SARS-CoV-2 v Etiópii

Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com. Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS. Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer). Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Zobrazuje karusel troch snímok naraz. Pomocou tlačidiel Predchádzajúci a Ďalší sa môžete pohybovať po troch snímkach naraz alebo pomocou posúvacích tlačidiel na konci môžete prechádzať tromi snímkami naraz.
Od vypuknutia koronavírusového ochorenia (COVID-19) v roku 2019 bolo na celom svete vyvinutých mnoho komerčných testov na amplifikáciu nukleových kyselín (NAAT), ktoré sa stali štandardnými testami. Hoci niekoľko testov bolo rýchlo vyvinutých a aplikovaných na laboratórne diagnostické testy, výkonnosť týchto testov nebola hodnotená v rôznych prostrediach. Preto sa táto štúdia zamerala na vyhodnotenie výkonnosti testov Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI a Sansure Biotech pomocou Composite Reference Standard (CRS). Štúdia sa uskutočnila v Etiópskom inštitúte verejného zdravia (EPHI) od 1. do 30. decembra 2020. 164 vzoriek z nosohltanu bolo extrahovaných pomocou mini súpravy QIAamp RNA a systému na prípravu vzoriek DNA od spoločnosti Abbott. Zo 164 vzoriek bolo 59,1 % pozitívnych a 40,9 % negatívnych na CRS. Pozitivita Sansure Biotech bola významne nízka v porovnaní s CRS (p < 0,05). Pozitivita Sansure Biotech bola významne nízka v porovnaní s CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Pozitívne výsledky Sansure Biotech boli výrazne nižšie v porovnaní s CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。 У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech mal významne menej pozitívnych výsledkov v porovnaní s CRS (p < 0,05).Celková zhoda štyroch analýz bola 96,3–100 % v porovnaní s CRS. Okrem nízkej miery pozitivity testu Sansure Biotech bola výkonnosť týchto štyroch testov takmer porovnateľná. Ako taký, test Sansure Biotech [Iba výskum (RUO)] vyžaduje dodatočné overenie na jeho použitie v Etiópii. Nakoniec by sa mal zvážiť ďalší výskum na vyhodnotenie testov s príslušnými tvrdeniami výrobcu.
Laboratórne testovanie je súčasťou Strategického plánu Svetovej zdravotníckej organizácie (WHO) pre pripravenosť a reakciu na koronavírusovú chorobu 2019 (COVID-19). WHO odporúča, aby krajiny vybudovali laboratórne kapacity na zlepšenie pripravenosti, správneho manažmentu prípadov, ostražitosti a rýchlej reakcie na výzvy v oblasti verejného zdravia. To naznačuje, že úloha laboratória je kľúčová pri charakterizácii choroby a epidemiológie vznikajúcich infekčných agens a pri kontrole ich šírenia.
Diagnóza COVID-19 vyžaduje epidemiologické a lekárske informácie, osobné symptómy/znaky a rádiografické a laboratórne údaje2. Od hlásenia prepuknutia COVID-19 v čínskom Wu-chane bolo na celom svete vyvinutých mnoho komerčných testov amplifikácie nukleových kyselín (NAAT). Reverzná transkripčná polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (rRT-PCR) sa používa ako rutinná a štandardná metóda na laboratórnu diagnostiku infekcie ťažkého akútneho respiračného syndrómu 2 (SARS-CoV-2)3. Molekulárna detekcia SARS-CoV-2 je typicky založená na génoch N (gén pre nukleokapsidový proteín), E (gén pre obalový proteín) a RdRp (gén pre RNA-polymerázu závislú od RNA) v ORF1a/b (otvorený čítací rámec 1a/b) . gén) oblasť identifikovaná z vírusového genómu. Sú považované za hlavné konzervované oblasti nachádzajúce sa vo vírusových genómoch na rozpoznávanie vírusov4. Spomedzi týchto génov majú gény RdRp a E vysokú analytickú citlivosť detekcie, zatiaľ čo gén N má nízku analytickú citlivosť5.
Výkonnosť testov PCR sa môže líšiť v závislosti od rôznych faktorov, ako sú: extrakčné činidlá, amplifikačné/detekčné činidlá, metóda extrakcie, kvalita PCR prístroja a iných nástrojov. Od apríla 2020 získalo povolenie na núdzové použitie (EUA) na diagnostiku COVID-196 viac ako 48 rôznych diagnostických zariadení z deviatich krajín. V Etiópii sa na PCR detekciu SARS-CoV-2 používa viac ako 14 platforiem real-time PCR v 26 inštitúciách verejného zdravotníctva vrátane ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 a Quant-studio7. Okrem toho sú k dispozícii rôzne testovacie súpravy PCR, ako je Daan Gene test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test a SARS-CoV-2 BGI test. Hoci je rRT-PCR vysoko citlivá, niektorí pacienti s COVID-19 hlásia falošne negatívne výsledky v dôsledku nedostatočných kópií vírusovej ribonukleovej kyseliny (RNA) vo vzorkách v dôsledku nesprávneho odberu, prepravy, skladovania a manipulácie a laboratórneho testovania. podmienky a činnosti personálu8. Okrem toho nesprávne zaobchádzanie so vzorkou alebo kontrolou, nastavenie prahu cyklu (Ct) a skrížená reaktivita s inými patogénnymi nukleovými kyselinami alebo neaktívnou/reziduálnou RNA SARS-CoV-2 môže viesť k falošne pozitívnym výsledkom v testoch rRT-PCR9. Je teda jasné, že PCR testy skutočne dokážu identifikovať nosičov génových fragmentov, keďže nedokážu rozlíšiť ani medzi skutočne aktívnymi vírusovými génmi, takže testy dokážu identifikovať iba nosičov a nie pacientov10. Preto je dôležité hodnotiť diagnostický výkon pomocou štandardných metód v našom prostredí. Hoci je veľa činidiel NAAT dostupných v Etiópskom inštitúte verejného zdravia (EPHI) a v celej krajine, zatiaľ nebolo hlásené žiadne porovnávacie hodnotenie ich účinnosti. Preto sa táto štúdia zamerala na vyhodnotenie porovnávacieho výkonu komerčne dostupných súprav na detekciu SARS-CoV-2 pomocou rRT-PCR s použitím klinických vzoriek.
Do tejto štúdie bolo zahrnutých celkovo 164 účastníkov s podozrením na COVID-19. Väčšina vzoriek bola z liečebných centier (118/164 = 72 %), zatiaľ čo zvyšných 46 (28 %) účastníkov bolo z neliečebných centier. Spomedzi účastníkov neliečených v centre malo 15 (9,1 %) klinicky podozrivé prípady a 31 (18,9 %) malo kontakty na potvrdené prípady. Deväťdesiattri (56,7 %) účastníkov boli muži a priemerný (± SD) vek účastníkov bol 31,10 (± 11,82) rokov.
V tejto štúdii boli stanovené pozitívne a negatívne miery štyroch testov na COVID-19. Pozitívne miery testu Abbott SARS-CoV-2, testu Daan Gene 2019-nCoV, testu SARS-CoV-2 BGI a testu Sansure Biotech 2019-nCoV boli teda 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % a 55,5 %, v uvedenom poradí. . Pozitívne a negatívne skóre kompozitného referenčného štandardu (CRS) boli 97 (59,1 %) a 67 (40,9 %) (tabuľka 1). V tejto štúdii bola definícia CRS založená na pravidle „akýkoľvek pozitívny“, pričom zo štyroch výsledkov testov boli dva alebo viac výsledkov testov, ktoré poskytli rovnaký výsledok, považované za skutočne pozitívne alebo negatívne.
V tejto štúdii sme našli negatívnu percentuálnu zhodu (NPA) 100 % (95 % CI 94,6–100) pre všetky analýzy v porovnaní s CRS. Analýza Sansure Biotechnology ukázala minimálnu PPA 93,8 % (95 % CI 87,2-97,1) a analýza Daan Gene 2019-nCoV mala celkovú zhodu 99,4 % (95 % CI 96,6-99,9). Na rozdiel od toho celková zhoda medzi testom SARS-CoV-2 BGI a testom Sansure Biotech 2019-nCoV bola 98,8 % a 96,3 % (tabuľka 2).
Cohenov koeficient kappa zhody medzi CRS a výsledkami testu Abbott SARS-CoV-2 bol úplne konzistentný (K = 1,00). Podobne aj Cohenove hodnoty kappa zistené pomocou Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI a Sansure Biotech 2019-nCoV sú tiež plne v súlade s CRS (K ≥ 0,925). V tejto porovnávacej analýze chí-kvadrát test (McNemarov test) ukázal, že výsledky testu Sansure Biotech 2019-nCoV sa významne líšili od výsledkov CRS (p = 0,031) (tabuľka 2).
Ako je znázornené na obr.1 bolo percento najnižšej hodnoty Ct (< 20 Ct) testu Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gén RdRp a N) 87,6 % a hodnota Ct génu ORF1a/b testu Sansure Biotech 2019-nCoV ukázala, že percento nízkych Hodnota Ct (< 20 Ct) bola 50,3 % a vysoká hodnota Ct (36–40 Ct) bola 3,2 %. 1 bolo percento najnižšej hodnoty Ct (< 20 Ct) testu Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gén RdRp a N) 87,6 % a hodnota Ct génu ORF1a/b testu Sansure Biotech 2019-nCoV ukázala, že percento nízkych Hodnota Ct (< 20 Ct) bola 50,3 % a vysoká hodnota Ct (36–40 Ct) bola 3,2 %.Ako je znázornené na obr.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированствилион Nар)Rd 87,6%, základná hodnota Ct ORF1a/b na základe Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкачо низкачо низкачо низказало составлял 50,3 %, а высокое значение Ct (36–40 Ct) составляло 3,2 %. 1, percento najnižšej hodnoty Ct (< 20 Ct) analýzy Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gén RdRp a N) bolo 87,6 % a hodnota Ct génovej analýzy ORF1a/b v Sansure Biotech 2019-nCoV ukázala že percento nízkej hodnoty Ct (< 20 Ct) predstavovalo 50,3 % a vysokej hodnoty Ct (36–40 Ct) tvorili 3,2 %.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比＼S亸 8 Ct Bio，< 20 Ct. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3 %，高Ct – 40 Ct (36)的百分比为 3,2 %。 Ako je znázornené na obrázku 1, najnižšie percento hodnoty Ct (< 20 Ct) testu Abbott SARS-CoV-2 (kombinácia génu RdRp a N) je 87,6 %, hodnota Ct génu ORF1a/b testu Sansure Biotech 2019-nCoV vykazuje nízke Ct值(< 20 Ct) 的 percento je 50,3 %, 高Ct值 (36–40 Ct) ± percento je 3,2 %. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp a N) имел самтое низкое значение Ct (< 20 Ct) v размере 87,6%, значение Ct гена ORF1a/b v исследовании Sansure Biotech 2019- значение Ананио низкий Ct. Ako je znázornené na obrázku 1, test Abbott SARS-CoV-2 (kombinujúci gény RdRp a N) mal najnižšiu percentuálnu hodnotu Ct (< 20 Ct) na úrovni 87,6 %, zatiaľ čo hodnota Ct génu ORF1a/b v Sansure Štúdia Biotech 2019 – Analýza nCoV ukázala nízke Ct. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3 %, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составиль 3,2 %. Percento hodnôt (< 20 Ct) bolo 50,3 % a percento vysokých hodnôt Ct (36–40 Ct) bolo 3,2 %.Abbott test SARS-CoV-2 B zaznamenal hodnoty Ct nad 30. Na druhej strane pri teste BGI SARS-CoV-2 mal gén ORF1a/b vysokú hodnotu Ct (> 36 Ct), percento bolo 4 % (obr. 1). Na druhej strane pri teste BGI SARS-CoV-2 mal gén ORF1a/b vysokú hodnotu Ct (> 36 Ct), percento bolo 4 % (obr. 1). С другой стороны, v анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), троцоторние составлял 4 % (рис. 1). Na druhej strane pri analýze génu BGI SARS-CoV-2 mal ORF1a/b vysokú hodnotu Ct (> 36 Ct), ktorej percento bolo 4 % (obr. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为分比为分比为分比为 4% Na druhej strane pri detekcii BGI SARS-CoV-2 je percento génu ORF1a/b s vysokou hodnotou Ct (>36 Ct) 4 % (obrázok 1). С другой стороны, v анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значенстиями Ct 4% (>36 Ct) (рис. 1). Na druhej strane v analýze BGI SARS-CoV-2 bolo percento génov ORF1a/b s vysokými hodnotami Ct (>36 Ct) 4 % (obr. 1).
V tejto štúdii sme odobrali 164 vzoriek z nosohltanu. Pre všetky typy testov sa izolácia a amplifikácia RNA uskutočnila pomocou metód a súprav odporúčaných príslušnými výrobcami.
Táto štúdia preukázala, že Abbottov test na SARS-CoV-2 má rovnaký detekčný výkon ako CRS, so 100 % pozitívnou, negatívnou a celkovou zhodou. Cohenova dohoda kappa je 1,00, čo naznačuje úplný súhlas s CRS. Podobná štúdia Washingtonskej univerzity v USA zistila, že celková citlivosť a špecifickosť Abbottovho testu na SARS-CoV-2 bola 93 % a 100 % v porovnaní s laboratórne stanoveným testom (LDA) CDC. . 11. Detekčný systém Abbott SARS-CoV-2 je založený na súčasnej kombinovanej detekcii génov N a RdRp, keďže oba gény sú citlivejšie, čím sa minimalizujú falošné negatíva12. Štúdia vo Viedni v Rakúsku tiež ukázala, že veľké objemy extrakčnej vzorky a objemy detekčného eluentu minimalizovali účinky riedenia a zvýšili účinnosť detekcie13. Abbottovu dokonalú zhodu pre test SARS-CoV-2 je teda možné spojiť s platformovým detekčným systémom, ktorý súčasne deteguje kombinatorické gény, extrahuje veľké množstvo vzoriek (0,5 ml) a používa veľké množstvo eluentu (40 µl).
Naše výsledky tiež ukázali, že detekčný výkon genetického testu Daan bol takmer rovnaký ako pri CRS. To je v súlade so štúdiou14 vykonanou na Univerzite Anhui v Huainane v Číne a tvrdením výrobcu o 100 % pozitívnej zhode. Napriek správam o konzistentných výsledkoch bola jedna vzorka falošne negatívna po opätovnom testovaní toho istého eluátu, ale bola pozitívna v testoch Abbott SARS-CoV-2 a Sansure Biotech nCoV-2019. To naznačuje, že môže existovať variabilita výsledkov v rôznych typoch testov. Napriek tomu v štúdii uskutočnenej v Číne15 bol výsledok testu Daan Gene významne odlišný (p < 0,05) v porovnaní s ich laboratórnym referenčným testom. Napriek tomu v štúdii uskutočnenej v Číne15 bol výsledok testu Daan Gene významne odlišný (p < 0,05) v porovnaní s ich laboratórnym referenčným testom. Тем не менее, v исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значиотелче 0,05) z toho лабораторного эtalonnoho анализа. V štúdii v Číne15 sa však výsledok analýzy Daan Gene výrazne líšil (p < 0,05) od laboratórnej referenčnej analýzy.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan зната отличались (p < 0,05) по сравнению с его эtalonnыm лабораторным тестом. V štúdii v Číne15 sa však výsledky Daanovho genetického testu výrazne líšili (p < 0,05) v porovnaní s referenčným laboratórnym testom.Tento nesúlad môže byť spôsobený citlivosťou referenčného testu na detekciu SARS-CoV-2 a na určenie príčiny môžu byť dôležité ďalšie štúdie.
Okrem toho naša štúdia hodnotila komparatívny výkon testu SARS-CoV-2 BGI s CRS, pričom preukázala vynikajúcu pozitívnu percentuálnu zhodu (PPA = 97,9 %), negatívnu percentuálnu zhodu (NPA = 100 %) a celkovú percentuálnu zhodu podľa pohlavia ( OPA). ). = 98,8 %). Cohenove hodnoty Kappa vykazovali dobrú zhodu (K = 0,975). Štúdie v Holandsku16 a Číne15 ukázali konzistentné výsledky. Test SARS-CoV-2 BGI je test na detekciu jedného génu (ORF1a/b) s použitím 10 µl amplifikačného/detekčného eluátu. Napriek dobrej štatistickej zhode s našimi referenčnými výsledkami, v analýze chýbali dve pozitívne vzorky (1,22 %) z celkovej vzorky. To môže mať obrovské klinické dôsledky pre dynamiku prenosu na úrovni pacienta aj komunity.
Ďalšou porovnávacou analýzou zahrnutou v tejto štúdii bol test Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); celkové percento zhody bolo 96,3 %. Sila zhody bola určená aj hodnotou Cohenovej Kappa, ktorá bola 0,925, čo naznačuje úplnú zhodu s CRS. Naše výsledky sú opäť totožné so štúdiami vykonanými na Central South University v Changsha v Číne a na oddelení klinického laboratória v Liuzhou People's Hospital, Liuzhou City, Čína17. Aj keď bola zaznamenaná vyššie uvedená dobrá štatistická zhoda, chí-kvadrát test (MacNemar test) ukázal, že výsledok testu Sansure Biotech mal štatisticky významný rozdiel v porovnaní s CRS (p < 0,005). Aj keď bola zaznamenaná vyššie uvedená dobrá štatistická zhoda, chí-kvadrát test (MacNemar test) ukázal, že výsledok testu Sansure Biotech mal štatisticky významný rozdiel v porovnaní s CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическотстирответ хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеетачтатистиозенский различие по сравнению с CRS (p < 0,005). Hoci bola zaznamenaná dobrá štatistická zhoda vyššie, chí-kvadrát test (McNemarov test) ukázal, že výsledok testu Sansure Biotech mal štatisticky významný rozdiel v porovnaní s CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验，但卡方检验（MacNemar 检验）表明擣绚表明统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明擣绚表明统计一致性相比具有统计学显着差异＂(p < 0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ［ biotech 朣与 crs 相比 具有 显着 （（p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。〉） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат Макнемара) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech a C Napriek dobrej štatistickej zhode uvedenej vyššie, chí-kvadrát test (McNemarov test) ukázal štatisticky významný rozdiel (p < 0,005) medzi testom Sansure Biotech a CRS.Zistilo sa, že šesť vzoriek (3,66 %) bolo falošne negatívnych v porovnaní s CRS (doplnková tabuľka 1); je to veľmi dôležité, najmä vzhľadom na dynamiku prenosu vírusu. Vyššie uvedené údaje tiež podporujú túto nízku mieru detekcie15.
V tejto štúdii boli hodnoty Ct stanovené pre každý test a príslušnú platformu, pričom najnižšia priemerná hodnota Ct bola zaznamenaná v teste Abbott SARS-CoV-2. Tento výsledok môže súvisieť so simultánnym kombinovaným genetickým testovacím systémom spoločnosti Abbott na detekciu SARS-CoV-2. Preto podľa obrázku 1 malo 87,6 % výsledkov Abbott SARS-CoV-2 hodnoty Ct nižšie ako 20. Len malý počet výsledkov vzorky (12,4 %) bol v rozmedzí 20-30. Hodnoty Ct nad 30 neboli zaznamenané. Okrem toho, že spoločnosť Abbott použila formát panelového genetického testovania SARS-CoV-2, môže tento výsledok súvisieť s dolným limitom detekcie (32,5 kópií RNA/ml)18, ktorý je trikrát nižší ako spodný limit spoločnosti 100 kópií RNA. /ml. ml)19.
Táto štúdia má určité obmedzenia: po prvé, nemáme štandardné/referenčné metódy [ako je vírusová záťaž alebo iné laboratórne testy (LDA)] z dôvodu nedostatku zdrojov. Po druhé, všetky vzorky použité v tejto štúdii boli výtery z nosohltanu, zatiaľ čo výsledky sa nedali použiť na iné typy vzoriek, a po tretie, veľkosť našej vzorky bola malá.
Táto štúdia porovnávala výkonnosť štyroch testov rRT-PCR pre SARS-CoV-2 s použitím vzoriek z nosohltanu. Všetky detekčné testy mali takmer porovnateľný výkon, s výnimkou testu Sansure Biotech. Okrem toho bola nízka miera pozitivity identifikovaná v teste Sansure Biotech v porovnaní s CRS (p < 0,05). Okrem toho bola nízka miera pozitivity identifikovaná v teste Sansure Biotech v porovnaní s CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов польных результостов 0,05). Okrem toho test Sansure Biotech ukázal nízke percento pozitívnych výsledkov v porovnaní s CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов положитель результатов поно 0,05). Okrem toho test Sansure Biotech mal nižšiu mieru pozitivity v porovnaní s CRS (p < 0,05).Analýza PPA, NPA a celkovej zhody Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) presiahla 93,5 % s hodnotou zhody Cohen Kappa 0,925. Napokon, test Sansure Biotech Assay (RUO) potrebuje ďalšie overenie na použitie v Etiópii a na vyhodnotenie tvrdení jednotlivých výrobcov by sa mal zvážiť ďalší výskum.
Návrh porovnávacej štúdie bol vykonaný v štyroch zdravotníckych zariadeniach v Addis Abebe, nemocnici Eka Kotebe, liečebnom stredisku Millenium Church, nemocnici Zewooditu Memorial a špecializovanej nemocnici na tuberkulózu sv. Petra. Údaje boli zozbierané medzi 1. a 31. decembrom 2020. Zdravotnícke zariadenia pre túto štúdiu boli vybrané účelovo na základe ich vysokého počtu prípadov a dostupnosti veľkých liečebných centier v meste. Podobne prístroje, vrátane prístrojov ABI 7500 a Abbott m2000 real-time PCR, boli vybrané podľa odporúčaní výrobcov NAAT reagencií a pre túto štúdiu boli vybrané štyri PCR detekčné súpravy, keďže väčšina laboratórií v Etiópii používala prinajmenšom štyri z nich. Génový test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test a SARS-CoV-2 BGI test vykonaný počas štúdie).
Testovanie na SARS-CoV-2 sa uskutočnilo od 1. do 30. decembra 2020 s použitím 3 ml vírusového transportného média (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Čína) od osôb vyšetrovaných na COVID-19 podľa EPHI. Vzorky z nosohltanu boli odobraté vyškolenými zberačmi vzoriek a odoslané do EPHI v trojitých baleniach. Pred izoláciou nukleovej kyseliny je každej vzorke pridelené jedinečné identifikačné číslo. Extrakcia sa vykonáva z každej vzorky ihneď po príchode pomocou manuálnych a automatických extrakčných metód. Na automatickú extrakciu Abbott m2000 sa teda 1,3 ml (vrátane 0,8 ml mŕtveho objemu a 0,5 ml extrakčného vstupného objemu) vzorky extrahovalo z každej vzorky a prešlo cez Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) Dávka 96 [92 vzoriek, dve detekčné kontroly a dve kontroly bez šablóny (NTC)] bola zahrnutá do celkového procesu (vyhľadanie a detekcia) dvoch kôl SARS-CoV-2 (EUA) v reálnom čase. baníctvo. Podobne pre manuálnu extrakciu použite rovnaké vzorky (pre automatickú extrakciu a objav). V priebehu procesu sa teda 140 ul vzorky rozdelili a extrahovali pomocou súpravy QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Nemecko) v dávkach po 24 (vrátane 20 vzoriek, dvoch kontrol testu a dvoch NTC) počas deviatich kôl. Manuálne extrahované eluáty sa amplifikovali a detegovali pomocou tepelného cyklovača ABI 7500 pomocou testu SARS-CoV-2 BGI, testu Daan Gene a testu Sansure Biotech.
Automatizovaná izolácia a purifikácia vírusovej RNA SARS-CoV-2 sa riadi princípom magnetických guľôčok s použitím činidiel na prípravu vzoriek DNA Abbott. Inaktivácia vzoriek a solubilizácia vírusových častíc sa uskutočňuje pomocou detergentu obsahujúceho guanidín izotiokyanát na denaturáciu proteínu a inaktiváciu RNázy. RNA sa potom oddelí od proteínu separáciou na pevnej fáze s použitím oxidu kremičitého, tj guanidíniová soľ a alkalické pH lyzačného pufra podporujú väzbu nukleových kyselín na oxid kremičitý (Si02). Oplachovací krok odstráni zvyšné proteíny a nečistoty, aby sa vytvoril číry roztok. Transparentná RNA sa izoluje z mikročastíc na báze oxidu kremičitého pomocou magnetického poľa prístroja20,21. Na druhej strane, ručná izolácia a purifikácia RNA sa vykonáva metódou rotačnej kolóny s použitím centrifugácie namiesto magnetického stojana a separácie mikročastíc z eluentu.
Abbott Real-Time SARS-CoV-2 Detection Test (Abbott Molecular, Inc.) bol vykonaný podľa pokynov výrobcu, ktorý získal EUA19,22 od WHO a FDA. V tomto protokole sa inaktivácia vzorky pred extrakciou uskutočnila vo vodnom kúpeli pri 56 ° C počas 30 minút. Po inaktivácii vírusu sa uskutočnila extrakcia nukleovej kyseliny na zariadení Abbott m2000 SP z 0,5 ml VTM s použitím systému na prípravu vzoriek DNA Abbott m2000. podľa výrobcu. Amplifikácia a detekcia sa uskutočňovali pomocou prístroja Abbott m2000 RT-PCR a duálna detekcia sa uskutočňovala pre RdRp a N gény. ROX) a VIC P (vlastné farbivo) na zacielenie a detekciu vnútorných kontrol, čo umožňuje súčasnú detekciu oboch amplifikačných produktov 19 .
Metóda amplifikačnej detekcie tejto súpravy je založená na jednokrokovej technológii RT-PCR. Gény ORF1a/b a N sa vybrali ako konzervované oblasti pomocou génovej technológie Daan na detekciu amplifikácie cieľovej oblasti. Na detekciu SARS-CoV-2 RNA vo vzorkách boli navrhnuté špecifické priméry a fluorescenčné sondy (sondy génu N označené FAM, sondy ORF1a/b označené VIC). Konečný eluent a hlavné zmesi sa pripravili pridaním 5 ul eluentu k 20 ul hlavnej zmesi na konečný objem 25 ul. Amplifikácia a detekcia sa uskutočňovali súčasne na prístroji ABI 750024 PCR v reálnom čase.
Gény ORF1a/b a N boli detegované pomocou diagnostickej súpravy Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (detekcia fluorescenčnou PCR). Pripravte špecifické sondy pre každý cieľový gén výberom kanála FAM pre oblasť ORF1a/b a kanála ROX pre gén N. K tejto testovacej súprave sa eluent a činidlá master mix pridajú nasledovne: pripravte 30 ul činidla master mix a 20 ul eluovanej vzorky na detekciu/amplifikáciu. Na amplifikáciu/detekciu sa použila real-time PCR ABI 750025.
Test SARS-CoV-2 BGI je fluorescenčná súprava rRT-PCR v reálnom čase na diagnostiku COVID-19. Cieľová oblasť sa nachádza v oblasti ORF1a/b genómu SARS-CoV-2, čo je metóda detekcie jedného génu. Okrem toho je ľudský gén pre domácnosť β-aktín vnútorne regulovaný cieľový gén. Hlavná zmes sa pripraví zmiešaním 20 µl činidla základnej zmesi a 10 µl extrahovanej vzorky RNA na platni s jamkami26. Na amplifikáciu a detekciu sa použil fluorescenčný kvantitatívny PCR prístroj v reálnom čase ABI 7500. Všetka amplifikácia nukleovej kyseliny, podmienky PCR pre každý test a interpretácia výsledkov sa uskutočňovali podľa príslušných pokynov výrobcu (tabuľka 3).
V tejto porovnávacej analýze sme nepoužili metódu referenčného štandardu na určenie percentuálnej zhody (pozitívnej, negatívnej a celkovej) a iných porovnávacích parametrov pre štyri analýzy. Každé porovnanie testu bolo vykonané s CRS, v tejto štúdii bol CRS stanovený pravidlom „akýkoľvek pozitívny“ a výsledok bol stanovený, nie jedným testom, použili sme aspoň dva zhodné výsledky testu. Navyše, v prípade prenosu COVID-19 sú falošne negatívne výsledky nebezpečnejšie ako falošne pozitívne výsledky. Preto, aby bolo možné čo najpresnejšie povedať „pozitívny“ z výsledku CRS, musia byť aspoň dva testy pozitívne, čo znamená, že aspoň jeden pozitívny výsledok bude pravdepodobne pochádzať z testu EUA. Zo štyroch výsledkov testov sa teda dva alebo viac výsledkov testov, ktoré dávajú rovnaký výsledok, považujú za skutočne pozitívne alebo negatívne18,27.
Údaje sa zbierali pomocou formulárov na extrakciu štruktúrovaných údajov, zadávanie údajov a analýza sa uskutočňovala pomocou štatistického softvéru Excel a SPSS verzie 23.0 pre popisnú štatistiku. Analyzovala sa pozitívna, negatívna a celková percentuálna zhoda a na určenie stupňa zhody každej metódy s CRS sa použilo skóre Kappa. Hodnoty kappa sa interpretujú nasledovne: 0,01 až 0,20 pre mierny súhlas, 0,21 až 0,40 pre všeobecný súhlas, 0,41 až 0,60 pre mierny súhlas, 0,61 až 0,80 pre veľký súhlas a 0,81 až 0,99 pre úplný súhlas28.
Etické schválenie bolo získané z University of Addis Abeba a všetky experimentálne protokoly pre túto štúdiu boli schválené Radou pre vedecké etické hodnotenie Etiópskeho inštitútu verejného zdravia. Referenčné číslo Etickej licencie EPHI je EPHI/IRB-279-2020. Všetky metódy boli aplikované v súlade s odporúčaniami a ustanoveniami etiópskych národných komplexných smerníc pre liečbu COVID-19. Okrem toho sa pred účasťou v štúdii získal písomný informovaný súhlas od všetkých účastníkov štúdie.
Všetky údaje získané alebo analyzované v tejto štúdii sú zahrnuté v tomto publikovanom článku. Údaje podporujúce výsledky tejto štúdie sú dostupné od príslušného autora na základe primeranej žiadosti.
Svetová zdravotnícka organizácia. Odporúčania pre stratégie laboratórneho testovania pre COVID-19: Dočasné usmernenia, 21. marca 2020 č. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Inteligentná diagnostika COVID-19 na oddelení pohotovosti: všetko v praxi. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Inteligentná diagnostika COVID-19 na oddelení pohotovosti: všetko v praxi.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. a Gurgulianis, KI Inteligentná diagnostika COVID-19 na pohotovostnom oddelení: všetko v praxi.Muliou DS, Pantazopoulos I. a Gurgulyanis KI Inteligentná diagnostika COVID-19 na pohotovostných oddeleniach: integrácia typu end-to-end v praxi. Expert Reverend Respire. liek. 3, 263 – 272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Hodnotenie testu COVID19 ID NOW EUA. Mitchell, SL & St George, K. Hodnotenie testu COVID19 ID NOW EUA.Mitchell, SL a St. George, K. Hodnotenie testu COVID19 ID NOW EUA.Mitchell SL a St. George K. Hodnotenie testu COVID19 ID NOW EUA. J. Clinical. Vírus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
SZO. Laboratórna detekcia koronavírusového ochorenia 2019 (COVID-19) pri podozrení na ľudské ochorenie. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (prístup 15. augusta 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. a kol. Diagnóza COVID-19: Choroby a testovacie nástroje. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. a kol. Založenie Kolégia patológov východnej, strednej a južnej Afriky – Regionálna škola patológie Blízkeho východu a Južnej Afriky. Afriky. J. Lab. liek. 9(1), 1-8 (2020).
Etiópsky inštitút verejného zdravia, federálne ministerstvo zdravotníctva. Dočasná národná stratégia a usmernenie pre laboratórnu diagnostiku COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (prístup 12. augusta 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Falošne negatívne testy na výzvy a dôsledky infekcie SARS-CoV-2. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Falošne negatívne testy na výzvy a dôsledky infekcie SARS-CoV-2.Voloshin S., Patel N. a Kesselheim AS Falošne negatívne testy na infekcie SARS-CoV-2 a ich dôsledky.Voloshin S., Patel N. a Kesselheim AS Falošne negatívne testy na provokáciu a vplyv infekcie SARS-CoV-2. N. eng. J. Medicine. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falošne pozitívne a falošne negatívne prípady COVID-19: Stratégie respiračnej prevencie a manažmentu, očkovanie a ďalšie perspektívy. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falošne pozitívne a falošne negatívne prípady COVID-19: Stratégie respiračnej prevencie a manažmentu, očkovanie a ďalšie perspektívy. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположительные a ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторнафипи стратегии лечения, вакцинация и дальнейшие перспективы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falošne pozitívne a falošne negatívne prípady COVID-19: stratégie respiračnej prevencie a liečby, očkovanie a cesta vpred.Muliu, DS a Gurgulianis, KI Falošne pozitívne a falošne negatívne prípady COVID-19: stratégie respiračnej prevencie a liečby, očkovanie a cesta vpred. Expert Reverend Respire. liek. 15(8), 993-1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Diagnóza COVID-19 na pohotovostnom oddelení: Vidieť strom, ale stratiť les. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Diagnóza COVID-19 na pohotovostnom oddelení: Vidieť strom, ale stratiť les.Mouliou, DS, Ioannis, P. a Konstantinos, G. Diagnóza COVID-19 na pohotovostnom oddelení: Vidieť strom, stratiť les.Muliou DS, Ioannis P. a Konstantinos G. Diagnóza COVID-19 v núdzových miestnostiach: Pre stromy nie je dosť lesa. Objavte sa. liek. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. a kol. Validácia a validácia analytickej a klinickej výkonnosti testu Abbott RealTime SARS-CoV-2. J. Clinical. Vírus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Porovnanie piatich súborov primérov z rôznych oblastí genómu COVID-19 na detekciu vírusovej infekcie konvenčnou RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Porovnanie piatich súborov primérov z rôznych oblastí genómu COVID-19 na detekciu vírusovej infekcie konvenčnou RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. a Aflatunyan, B. Porovnanie piatich súborov primérov z rôznych oblastí genómu COVID-19 na detekciu vírusovej infekcie konvenčnou RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Porovnanie 5 rôznych genetických oblastí COVID-19 na detekciu vírusovej infekcie konvenčnou RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. a Aflatunyan B. Porovnanie piatich súborov primérov z rôznych oblastí genómu COVID-19 na detekciu vírusovej infekcie konvenčnou RT-PCR.Irán. J. Microbiology. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. a kol. Predbežné výsledky národného programu externého hodnotenia kvality na detekciu sekvencií genómu SARS-CoV-2. J. Clinical. Vírus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. a kol. Analytické vyhodnotenie účinnosti piatich súprav RT-PCR pre koronavírus s ťažkým akútnym respiračným syndrómom 2. J. Klinické. laboratórium. konečník. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. a kol. Hodnotenie siedmich komerčne dostupných súprav na detekciu SARS-CoV-2 RNA v Číne na základe polymerázovej reťazovej reakcie v reálnom čase (PCR). klinický. Chemický. laboratórium. liek. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB a kol. Porovnanie siedmich komerčných diagnostických súprav RT-PCR COVID-19. J. Clinical. Vírus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu a kol. Porovnanie diagnostického výkonu dvoch PCR súprav na detekciu SARS-CoV-2 nukleových kyselín. J. Clinical. laboratórium. konečník. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR atď. Porovnávacia štúdia štyroch platforiem testovania amplifikácie nukleovej kyseliny SARS-CoV-2 (NAAT) ukázala, že výkonnosť ID NOW bola významne znížená v závislosti od pacienta a typu vzorky. diagnózy. mikrobiológie. Infikovať. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbottova molekula. Príbalový leták spoločnosti Abbott na analýzu SARS-CoV-2 v reálnom čase. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (K 10. augustu 2020) (2020).
Klein, S. a kol. Izolácia RNA SARS-CoV-2 pomocou magnetických guľôčok na rýchlu detekciu vo veľkom meradle pomocou RT-qPCR a RT-LAMP. Vírus 12(8), 863 (2020).