Vykonanie štyroch testov amplifikácie nukleových kyselín na identifikáciu SARS-CoV-2 v Etiópii

Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Zobrazí karusel s tromi snímkami naraz. Pomocou tlačidiel Predchádzajúca a Nasledujúca sa môžete pohybovať medzi tromi snímkami naraz alebo pomocou tlačidiel posuvníka na konci sa môžete pohybovať medzi tromi snímkami naraz.
Od vypuknutia koronavírusového ochorenia (COVID-19) v roku 2019 bolo na celom svete vyvinutých mnoho komerčných testov amplifikácie nukleových kyselín (NAAT), ktoré sa stali štandardnými testami. Hoci bolo niekoľko testov rýchlo vyvinutých a aplikovaných na laboratórne diagnostické testy, ich výkonnosť nebola hodnotená v rôznych prostrediach. Preto sa táto štúdia zamerala na vyhodnotenie výkonnosti testov Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI a Sansure Biotech s použitím kompozitného referenčného štandardu (CRS). Štúdia sa uskutočnila v Etiópskom inštitúte verejného zdravia (EPHI) od 1. do 30. decembra 2020. 164 vzoriek nosohltanu bolo extrahovaných pomocou mini súpravy QIAamp RNA a systému na prípravu vzoriek Abbott DNA. Zo 164 vzoriek bolo 59,1 % pozitívnych a 40,9 % negatívnych na CRS. Pozitivita testu Sansure Biotech bola v porovnaní s CRS významne nízka (p < 0,05). Pozitivita testu Sansure Biotech bola v porovnaní s CRS významne nízka (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Pozitívne výsledky spoločnosti Sansure Biotech boli v porovnaní s CRS významne nižšie (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。 У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Spoločnosť Sansure Biotech mala v porovnaní s CRS významne menej pozitívnych výsledkov (p < 0,05).Celková zhoda štyroch analýz bola 96,3 – 100 % v porovnaní s CRS. Okrem nízkej miery pozitivity testu Sansure Biotech bola výkonnosť štyroch testov takmer porovnateľná. Preto test Sansure Biotech [Iba výskum (RUO)] vyžaduje dodatočnú validáciu pre svoje použitie v Etiópii. Nakoniec by sa mal zvážiť ďalší výskum na vyhodnotenie testov s príslušnými tvrdeniami výrobcu.
Laboratórne testovanie je súčasťou Strategického plánu Svetovej zdravotníckej organizácie (WHO) pre pripravenosť a reakciu na koronavírusovú chorobu na rok 2019 (COVID-19) (SPRP). WHO odporúča, aby krajiny vybudovali laboratórne kapacity na zlepšenie pripravenosti, správneho manažmentu prípadov, ostražitosti a rýchlej reakcie na výzvy verejného zdravia. To naznačuje, že úloha laboratória je kľúčová pre charakterizáciu ochorenia a epidemiológiu nových infekčných agensov a kontrolu ich šírenia.
Diagnóza COVID-19 si vyžaduje epidemiologické a lekárske informácie, osobné príznaky/prejavy a rádiografické a laboratórne údaje2. Odkedy bolo vo Wu-chane v Číne hlásené prepuknutie COVID-19, bolo na celom svete vyvinutých mnoho komerčných testov amplifikácie nukleových kyselín (NAAT). Reťazová reakcia s reverznou transkripciou v reálnom čase (rRT-PCR) sa používa ako rutinná a štandardná metóda laboratórnej diagnostiky infekcie závažným akútnym respiračným syndrómom 2 (SARS-CoV-2)3. Molekulárna detekcia SARS-CoV-2 je typicky založená na génoch N (gén nukleokapsidového proteínu), E (gén obalového proteínu) a RdRp (gén RNA-dependentnej RNA polymerázy) v oblasti ORF1a/b (gén otvoreného čítacieho rámca 1a/b) identifikovanej z vírusového genómu. Považujú sa za hlavné konzervované oblasti nachádzajúce sa vo vírusových genómoch na rozpoznávanie vírusov4. Spomedzi týchto génov majú gény RdRp a E vysokú analytickú citlivosť detekcie, zatiaľ čo gén N má nízku analytickú citlivosť5.
Výkonnosť PCR testov sa môže líšiť v závislosti od rôznych faktorov, ako sú: extrakčné činidlá, amplifikačné/detekčné činidlá, extrakčná metóda, kvalita PCR prístroja a ďalších nástrojov. K aprílu 2020 získalo povolenie na núdzové použitie (EUA) na diagnostiku COVID-196 viac ako 48 rôznych diagnostických zariadení z deviatich krajín. V Etiópii sa na PCR detekciu SARS-CoV-2 používa viac ako 14 real-time PCR platforiem v 26 verejných zdravotníckych zariadeniach vrátane ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 a Quant-studio7. Okrem toho sú k dispozícii rôzne PCR testovacie súpravy, ako napríklad Daan Gene test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test a SARS-CoV-2 BGI test. Hoci je rRT-PCR vysoko citlivá, niektorí pacienti s COVID-19 hlásia falošne negatívne výsledky z dôvodu nedostatočného počtu kópií vírusovej ribonukleovej kyseliny (RNA) vo vzorkách v dôsledku nesprávneho odberu, prepravy, skladovania a manipulácie a laboratórnych testov, podmienok a konania personálu8. Okrem toho, nesprávna manipulácia so vzorkou alebo kontrolnou vzorkou, nastavenie prahu cyklu (Ct) a skrížená reaktivita s inými patogénnymi nukleovými kyselinami alebo inaktívnou/zvyškovou RNA SARS-CoV-2 môžu viesť k falošne pozitívnym výsledkom v testoch rRT-PCR9. Je teda zrejmé, že PCR testy skutočne dokážu identifikovať nosičov génových fragmentov, pretože nedokážu rozlíšiť ani medzi skutočne aktívnymi vírusovými génmi, takže testy dokážu identifikovať iba nosičov a nie pacientov10. Preto je dôležité posúdiť diagnostický výkon pomocou štandardných metód v našom prostredí. Hoci v Etiópskom inštitúte verejného zdravia (EPHI) a v celej krajine je dostupných mnoho NAAT činidiel, zatiaľ nebolo publikované žiadne porovnávacie hodnotenie ich účinnosti. Preto sa cieľom tejto štúdie stalo vyhodnotenie porovnávacieho výkonu komerčne dostupných súprav na detekciu SARS-CoV-2 pomocou rRT-PCR s použitím klinických vzoriek.
Do tejto štúdie bolo zahrnutých celkovo 164 účastníkov s podozrením na COVID-19. Väčšina vzoriek pochádzala z liečebných centier (118/164 = 72 %), zatiaľ čo zvyšných 46 (28 %) účastníkov pochádzalo z neliečebných centier. Spomedzi účastníkov, ktorí neboli liečení v centre, malo 15 (9,1 %) klinicky podozrivé prípady a 31 (18,9 %) malo kontakty s potvrdenými prípadmi. Deväťdesiattri (56,7 %) účastníkov boli muži a priemerný (± SD) vek účastníkov bol 31,10 (± 11,82) rokov.
V tejto štúdii boli stanovené miery pozitívnych a negatívnych výsledkov štyroch testov na COVID-19. Miera pozitívnych výsledkov testu Abbott SARS-CoV-2, testu Daan Gene 2019-nCoV, testu SARS-CoV-2 BGI a testu Sansure Biotech 2019-nCoV bola teda 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % a 55,5 %. Skóre pozitívneho a negatívneho kompozitného referenčného štandardu (CRS) bolo 97 (59,1 %) a 67 (40,9 %) (Tabuľka 1). V tejto štúdii bola definícia CRS založená na pravidle „akýkoľvek pozitívny“, pričom zo štyroch výsledkov testov boli dva alebo viac výsledkov testov s rovnakým výsledkom považované za skutočne pozitívne alebo skutočne negatívne.
V tejto štúdii sme zistili negatívnu percentuálnu zhodu (NPA) 100 % (95 % CI 94,6 – 100) pre všetky analýzy v porovnaní s CRS. Analýza Sansure Biotechnology ukázala minimálnu PPA 93,8 % (95 % CI 87,2 – 97,1) a analýza Daan Gene 2019-nCoV mala celkovú zhodu 99,4 % (95 % CI 96,6 – 99,9). Naproti tomu celková zhoda medzi testom SARS-CoV-2 BGI a testom Sansure Biotech 2019-nCoV bola 98,8 % a 96,3 % (Tabuľka 2).
Cohenov koeficient zhody kappa medzi výsledkami CRS a Abbott SARS-CoV-2 testu bol plne konzistentný (K = 1,00). Podobne aj Cohenove hodnoty kappa zistené pomocou Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI a Sansure Biotech 2019-nCoV sú plne konzistentné s CRS (K ≥ 0,925). V tejto porovnávacej analýze chí-kvadrát test (McNemarov test) ukázal, že výsledky testu Sansure Biotech 2019-nCoV sa významne líšili od výsledkov CRS (p = 0,031) (Tabuľka 2).
Ako je znázornené na obr.1 Percento najnižšej hodnoty Ct (< 20 Ct) v teste Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gén RdRp a N) bolo 87,6 % a hodnota Ct génu ORF1a/b v teste Sansure Biotech 2019-nCoV ukázala, že percento nízkej hodnoty Ct (< 20 Ct) bolo 50,3 % a vysokej hodnoty Ct (36 – 40 Ct) bolo 3,2 %. 1 Percento najnižšej hodnoty Ct (< 20 Ct) v teste Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gén RdRp a N) bolo 87,6 % a hodnota Ct génu ORF1a/b v teste Sansure Biotech 2019-nCoV ukázala, že percento nízkej hodnoty Ct (< 20 Ct) bolo 50,3 % a vysokej hodnoty Ct (36 – 40 Ct) bolo 3,2 %.Ako je znázornené na obr.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированствилион Nар)Rd 87,6%, základná hodnota Ct ORF1a/b na základe Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкачо низкачо низкачо низказало составлял 50,3 %, а высокое значение Ct (36–40 Ct) составляло 3,2 %. 1, percento najnižšej hodnoty Ct (< 20 Ct) analýzy Abbott SARS-CoV-2 (kombinovaný gén RdRp a N) bolo 87,6 % a analýza hodnoty Ct génu ORF1a/b od Sansure Biotech 2019-nCoV ukázala, že percento nízkej hodnoty Ct (< 20 Ct) predstavovalo 50,3 % a vysokej hodnoty Ct (36 – 40 Ct) predstavovalo 3,2 %.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比＼S亸 8 Ct Bio，< 20 Ct. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3 %，高Ct – 40 Ct (36)的百分比为 3,2 %。 Ako je znázornené na obrázku 1, najnižšia percentuálna hodnota Ct (< 20 Ct) testu Abbott SARS-CoV-2 (kombinácia génu RdRp a N) je 87,6 %, hodnota Ct génu ORF1a/b testu Sansure Biotech 2019-nCoV vykazuje nízke percento Ct值(< 20 Ct) je 50,3 % a percento Ct 高(36–40 Ct) je 3,2 %. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp a N) имел самтое низкое значение Ct (< 20 Ct) v размере 87,6%, значение Ct гена ORF1a/b v исследовании Sansure Biotech 2019- значение Ананио низкий Ct. Ako je znázornené na obrázku 1, test Abbott SARS-CoV-2 (kombinujúci gény RdRp a N) mal najnižšiu percentuálnu hodnotu Ct (< 20 Ct) na úrovni 87,6 %, zatiaľ čo hodnota Ct génu ORF1a/b v štúdii Sansure Biotech 2019 – Analýza nCoV ukázala nízku hodnotu Ct. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3 %, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составиль 3,2 %. Percento hodnôt (< 20 Ct) bolo 50,3 % a percento vysokých hodnôt Ct (36 – 40 Ct) bolo 3,2 %.Test Abbott SARS-CoV-2 B zaznamenal hodnoty Ct nad 30. Na druhej strane, v teste BGI SARS-CoV-2 mal gén ORF1a/b vysokú hodnotu Ct (> 36 Ct), percento bolo 4 % (obr. 1). Na druhej strane, v teste BGI SARS-CoV-2 mal gén ORF1a/b vysokú hodnotu Ct (> 36 Ct), percento bolo 4 % (obr. 1). С другой стороны, v анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), троцоторние составлял 4 % (рис. 1). Na druhej strane, v analýze BGI mal gén ORF1a/b SARS-CoV-2 vysokú hodnotu Ct (> 36 Ct), ktorej percento bolo 4 % (obr. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为分比为分比为分比为 4% Na druhej strane, pri detekcii SARS-CoV-2 pomocou BGI je percento génu ORF1a/b s vysokou hodnotou Ct (> 36 Ct) 4 % (obrázok 1). С другой стороны, v анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значенстиями Ct 4% (>36 Ct) (рис. 1). Na druhej strane, v analýze BGI SARS-CoV-2 bolo percento génov ORF1a/b s vysokými hodnotami Ct ​​(>36 Ct) 4 % (obr. 1).
V tejto štúdii sme odobrali 164 vzoriek z nosohltana. Pri všetkých typoch testov sa izolácia a amplifikácia RNA vykonala pomocou metód a súprav odporúčaných príslušnými výrobcami.
Táto štúdia preukázala, že Abbottov test na SARS-CoV-2 má rovnaký detekčný výkon ako CRS so 100 % pozitívnym, negatívnym a celkovým zhodným výsledkom. Cohenova kappa zhoda je 1,00, čo naznačuje úplnú zhodu s CRS. Podobná štúdia Washingtonskej univerzity v USA zistila, že celková citlivosť a špecificita Abbottovho testu na SARS-CoV-2 bola 93 % a 100 % v porovnaní s laboratórne stanoveným testom (LDA) CDC. 11. Detekčný systém Abbott SARS-CoV-2 je založený na súčasnej kombinovanej detekcii génov N a RdRp, pretože oba gény sú citlivejšie, čím sa minimalizujú falošne negatívne výsledky12. Štúdia vo Viedni v Rakúsku tiež ukázala, že veľké objemy extrakčnej vzorky a objemy detekčného eluentu minimalizovali účinky riedenia a zvýšili účinnosť detekcie13. Abbottov dokonalý test SARS-CoV-2 teda možno spojiť s detekčným systémom na platforme, ktorý súčasne deteguje kombinatorické gény, extrahuje veľké množstvo vzoriek (0,5 ml) a používa veľké množstvo eluentu (40 µl).
Naše výsledky tiež ukázali, že detekčná účinnosť genetického testu Daan bola takmer rovnaká ako u CRS. To je v súlade so štúdiou14 vykonanou na Univerzite Anhui v Huainane v Číne a s tvrdením výrobcu o 100 % pozitívnej zhode. Napriek správam o konzistentných výsledkoch bola jedna vzorka po opakovanom testovaní toho istého eluátu falošne negatívna, ale v testoch Abbott SARS-CoV-2 a Sansure Biotech nCoV-2019 bola pozitívna. To naznačuje, že výsledky môžu byť variabilné medzi rôznymi typmi testov. Napriek tomu sa v štúdii vykonanej v Číne15 výsledok testu Daan Gene významne líšil (p < 0,05) v porovnaní s ich laboratórne definovaným referenčným testom. Napriek tomu sa v štúdii vykonanej v Číne15 výsledok testu Daan Gene významne líšil (p < 0,05) v porovnaní s ich laboratórne definovaným referenčným testom. Тем не менее, v исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значиотелче 0,05) z toho лабораторного эtalonnoho анализа. V štúdii v Číne15 sa však výsledok analýzy spoločnosti Daan Gene významne líšil (p < 0,05) od ich referenčnej laboratórnej analýzy.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan зната отличались (p < 0,05) по сравнению с его эtalonnыm лабораторным тестом. V štúdii v Číne15 sa však výsledky Daanovho genetického testu významne líšili (p < 0,05) v porovnaní s testom v referenčnom laboratóriu.Táto nezrovnalosť môže byť spôsobená citlivosťou referenčného testu na detekciu SARS-CoV-2 a na určenie príčiny môžu byť dôležité ďalšie štúdie.
Naša štúdia okrem toho hodnotila porovnávaciu výkonnosť testu SARS-CoV-2 BGI s CRS, pričom preukázala vynikajúcu pozitívnu percentuálnu zhodu (PPA = 97,9 %), negatívnu percentuálnu zhodu (NPA = 100 %) a celkovú percentuálnu zhodu podľa pohlavia (OPA). = 98,8 %). Hodnoty Cohenovho Kappa vykazovali dobrú zhodu (K = 0,975). Štúdie v Holandsku16 a Číne15 preukázali konzistentné výsledky. Test SARS-CoV-2 BGI je test na detekciu jedného génu (ORF1a/b) s použitím 10 µl amplifikačného/detekčného eluátu. Napriek dobrej štatistickej zhode s našimi referenčnými výsledkami analýza vynechala dve pozitívne vzorky (1,22 %) z celkovej vzorky. To môže mať obrovské klinické dôsledky pre dynamiku prenosu na úrovni pacienta aj komunity.
Ďalšou porovnávacou analýzou zahrnutou v tejto štúdii bol test Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); celkové percento zhody bolo 96,3 %. Sila zhody bola tiež určená hodnotou Cohenovho Kappa, ktorá bola 0,925, čo naznačuje úplnú zhodu s CRS. Naše výsledky sú opäť identické so štúdiami vykonanými na Central South University v Changsha v Číne a na oddelení klinického laboratória Ľudovej nemocnice Liuzhou v meste Liuzhou v Číne17. Aj keď bola zaznamenaná vyššie uvedená dobrá štatistická zhoda, chí-kvadrát test (MacNemarov test) ukázal, že výsledok testu Sansure Biotech mal štatisticky významný rozdiel v porovnaní s CRS (p < 0,005). Aj keď bola zaznamenaná vyššie uvedená dobrá štatistická zhoda, chí-kvadrát test (MacNemarov test) ukázal, že výsledok testu Sansure Biotech mal štatisticky významný rozdiel v porovnaní s CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическотстирответ хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеетачтатистиозенский различие по сравнению с CRS (p < 0,005). Hoci bola zaznamenaná dobrá štatistická zhoda uvedená vyššie, chí-kvadrát test (McNemarov test) ukázal, že výsledok testu Sansure Biotech mal štatisticky významný rozdiel v porovnaní s CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验，但卡方检验（MacNemar 检验）表明擣绚表明统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明擣绚表明统计一致性相比具有统计学显着差异＂(p < 0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ［ biotech 朣与 crs 相比 具有 显着 （（p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。〉） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат Макнемара) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech a C Napriek vyššie uvedenej dobrej štatistickej zhode, chí-kvadrát test (McNemarov test) preukázal štatisticky významný rozdiel (p < 0,005) medzi testom Sansure Biotech a CRS.Šesť vzoriek (3,66 %) bolo v porovnaní s CRS falošne negatívnych (doplnková tabuľka 1); to je veľmi dôležité, najmä vzhľadom na dynamiku prenosu vírusu. Vyššie uvedené údaje tiež podporujú túto nízku mieru detekcie15.
V tejto štúdii boli hodnoty Ct stanovené pre každý test a príslušnú platformu, pričom najnižšia priemerná hodnota Ct bola zaznamenaná v teste Abbott SARS-CoV-2. Tento výsledok môže súvisieť so systémom simultánneho kombinovaného genetického testovania spoločnosti Abbott na detekciu SARS-CoV-2. Preto podľa obrázku 1 malo 87,6 % výsledkov Abbott SARS-CoV-2 hodnoty Ct pod 20. Iba malý počet výsledkov vzoriek (12,4 %) bol v rozmedzí 20 – 30. Hodnoty Ct nad 30 neboli zaznamenané. Okrem toho, že spoločnosť Abbott používala formát genetického testovania panelu SARS-CoV-2, môže tento výsledok súvisieť s dolným detekčným limitom (32,5 kópií RNA/ml)18, ktorý je trikrát nižší ako dolný limit spoločnosti 100 kópií RNA/ml)19.
Táto štúdia má určité obmedzenia: po prvé, nemáme štandardné/referenčné metódy [ako napríklad vírusovú záťaž alebo iné laboratórne testy (LDA)] z dôvodu nedostatku zdrojov. Po druhé, všetky vzorky použité v tejto štúdii boli výtery z nosohltana, pričom výsledky neboli použiteľné pre iné typy vzoriek, a po tretie, naša vzorka bola malá.
Táto štúdia porovnávala výkonnosť štyroch rRT-PCR testov na SARS-CoV-2 s použitím vzoriek z nosohltana. Všetky detekčné testy mali takmer porovnateľnú výkonnosť, s výnimkou testu Sansure Biotech. Okrem toho bola v teste Sansure Biotech identifikovaná nízka miera pozitivity v porovnaní s CRS (p < 0,05). Okrem toho bola v teste Sansure Biotech identifikovaná nízka miera pozitivity v porovnaní s CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов польных результостов 0,05). Okrem toho test Sansure Biotech vykazoval nízke percento pozitívnych výsledkov v porovnaní s CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов положитель результатов поно 0,05). Okrem toho mal test Sansure Biotech nižšiu mieru pozitivity v porovnaní s CRS (p < 0,05).Analýza PPA, NPA a celkovej zhody vykonaná spoločnosťou Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) prekročila 93,5 % s hodnotou sily zhody Cohen Kappa 0,925. Nakoniec, test Sansure Biotech (RUO) si vyžaduje ďalšie overenie na použitie v Etiópii a mal by sa zvážiť ďalší výskum na vyhodnotenie tvrdení od jednotlivých výrobcov.
Porovnávacia štúdia bola vykonaná v štyroch zdravotníckych zariadeniach v Addis Abebe: v nemocnici Eka Kotebe, v liečebnom centre Millennium Church, v nemocnici Zewooditu Memorial Hospital a v špecializovanej nemocnici pre tuberkulózu sv. Petra. Údaje boli zozbierané medzi 1. a 31. decembrom 2020. Zdravotnícke zariadenia pre túto štúdiu boli cielene vybrané na základe vysokého počtu prípadov a dostupnosti hlavných liečebných centier v meste. Podobne boli podľa odporúčaní výrobcov činidiel NAAT vybrané aj prístroje vrátane prístrojov na PCR v reálnom čase ABI 7500 a Abbott m2000 a pre túto štúdiu boli vybrané štyri súpravy na detekciu PCR, keďže väčšina laboratórií v Etiópii používala aspoň štyri z nich. Počas štúdie bol vykonaný génový test, test Abbott SARS-CoV-2, test Sansure Biotech a test SARS-CoV-2 BGI.
Testovanie na SARS-CoV-2 sa vykonávalo od 1. do 30. decembra 2020 s použitím 3 ml vírusového transportného média (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Čína) od osôb vyšetrovaných na COVID-19, ktoré boli odoslané do EPHI. Vzorky z nosohltana odobrali vyškolení zberači vzoriek a zaslali ich do EPHI v trojitých baleniach. Pred izoláciou nukleových kyselín je každej vzorke priradené jedinečné identifikačné číslo. Extrakcia sa z každej vzorky vykonáva ihneď po jej prijatí pomocou manuálnych a automatických extrakčných metód. Pre automatickú extrakciu Abbott m2000 sa teda z každej vzorky extrahovalo 1,3 ml (vrátane 0,8 ml mŕtveho objemu a 0,5 ml vstupného objemu extrakcie) vzorky a prešlo systémom Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) Do celkového procesu (získavanie a detekcia) dvoch kôl SARS-CoV-2 (EUA) v reálnom čase bola zahrnutá dávka 96 vzoriek [92 vzoriek, dve detekčné kontroly a dve netemplátové kontroly (NTC)]. ťažba. Podobne, pri manuálnej extrakcii použite rovnaké vzorky (pre automatickú extrakciu a detekciu). Počas celého procesu bolo teda rozdelených 140 µl vzoriek do alikvotných množstiev a extrahovaných pomocou súpravy QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Nemecko) v dávkach po 24 vzorkách (vrátane 20 vzoriek, dvoch kontrolných vzoriek a dvoch NTC) počas deviatich kôl. Manuálne extrahované eluáty boli amplifikované a detegované pomocou termocykléra ABI 7500 s použitím testu SARS-CoV-2 BGI, testu Daan Gene a testu Sansure Biotech.
Automatická izolácia a purifikácia vírusovej RNA SARS-CoV-2 sa riadi princípom magnetických guľôčok s použitím činidiel na prípravu vzoriek DNA Abbott. Inaktivácia vzoriek a solubilizácia vírusových častíc sa vykonáva pomocou detergentu obsahujúceho guanidín izotiokyanát na denaturáciu proteínu a inaktiváciu RNázy. RNA sa potom oddelí od proteínu separáciou na pevnej fáze s použitím oxidu kremičitého, t. j. guanidíniová soľ a alkalické pH lyzačného pufra podporujú väzbu nukleových kyselín na oxid kremičitý (SiO2). Krok oplachovania odstráni zvyšné proteíny a nečistoty, čím sa vytvorí číry roztok. Transparentná RNA sa izoluje z mikročastíc na báze oxidu kremičitého pomocou magnetického poľa prístroja20,21. Na druhej strane, manuálna izolácia a purifikácia RNA sa vykonáva metódou rotačnej kolóny s použitím centrifugácie namiesto magnetického stojana a separácie mikročastíc od eluentu.
Abbott Real-Time SARS-CoV-2 Detection Test (Abbott Molecular, Inc.) sa vykonal podľa pokynov výrobcu, ktorý získal EUA19,22 od WHO a FDA. V tomto protokole sa inaktivácia vzorky pred extrakciou uskutočnila vo vodnom kúpeli pri teplote 56 °C počas 30 minút. Po inaktivácii vírusu sa extrakcia nukleovej kyseliny uskutočnila na prístroji Abbott m2000 SP z 0,5 ml VTM s použitím systému na prípravu vzoriek DNA Abbott m2000 podľa pokynov výrobcu. Amplifikácia a detekcia sa vykonali pomocou prístroja Abbott m2000 RT-PCR a pre gény RdRp a N sa vykonala duálna detekcia. Na zacielenie a detekciu interných kontrol sa použili farbivá ROX) a VIC P (proprietárne farbivo) , čo umožnilo simultánnu detekciu oboch amplifikačných produktov 19 .
Metóda detekcie amplifikácie tejto súpravy je založená na jednokrokovej technológii RT-PCR. Gény ORF1a/b a N boli vybrané spoločnosťou Daan Gene Technology ako konzervované oblasti na detekciu amplifikácie cieľovej oblasti. Na detekciu RNA SARS-CoV-2 vo vzorkách boli navrhnuté špecifické priméry a fluorescenčné sondy (sondy génu N značené FAM, sondy ORF1a/b značené VIC). Finálny eluent a master mixy boli pripravené pridaním 5 µl eluentu k 20 µl master mixu do konečného objemu 25 µl. Amplifikácia a detekcia boli vykonané súčasne na prístroji ABI 750024 pre real-time PCR.
Gény ORF1a/b a N boli detegované pomocou súpravy Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (detekcia fluorescenčnou PCR). Pre každý cieľový gén pripravte špecifické sondy výberom kanála FAM pre oblasť ORF1a/b a kanála ROX pre gén N. Do tejto testovacej súpravy sa pridá eluent a master mix činidiel nasledovne: pripravte 30 µl master mix činidla a 20 µl eluovanej vzorky na detekciu/amplifikáciu. Na amplifikáciu/detekciu sa použila real-time PCR ABI 750025.
Test SARS-CoV-2 BGI je fluorescenčná súprava na real-time rRT-PCR na diagnostiku COVID-19. Cieľová oblasť sa nachádza v oblasti ORF1a/b genómu SARS-CoV-2, čo je metóda detekcie jedného génu. Okrem toho je ľudský gén β-aktín interne regulovaným cieľovým génom. Master mix sa pripraví zmiešaním 20 µl činidla master mix a 10 µl extrahovanej vzorky RNA v jamkovej platni26. Na amplifikáciu a detekciu sa použil fluorescenčný kvantitatívny prístroj na real-time PCR ABI 7500. Všetky amplifikácie nukleových kyselín, podmienky PCR pre každý test a interpretácia výsledkov sa vykonali podľa príslušných pokynov výrobcu (Tabuľka 3).
V tejto porovnávacej analýze sme nepoužili metódu referenčného štandardu na určenie percentuálnej zhody (pozitívna, negatívna a celková) a ďalších porovnávacích parametrov pre štyri analýzy. Každé porovnanie testov sa uskutočnilo s CRS, v tejto štúdii bol CRS stanovený pravidlom „akýkoľvek pozitívny“ a výsledok nebol určený jedným testom, použili sme aspoň dva porovnateľné výsledky testov. Okrem toho, v prípade prenosu COVID-19 sú falošne negatívne výsledky nebezpečnejšie ako falošne pozitívne výsledky. Preto, aby sa z výsledku CRS dalo čo najpresnejšie povedať „pozitívny“, musia byť aspoň dva testy pozitívne, čo znamená, že aspoň jeden pozitívny výsledok pravdepodobne pochádza z testu EUA. Zo štyroch výsledkov testov sa teda dva alebo viac výsledkov testov, ktoré poskytujú rovnaký výsledok, považujú za skutočne pozitívne alebo negatívne18,27.
Dáta boli zhromaždené pomocou štruktúrovaných formulárov na extrakciu dát, zadávanie a analýza dát boli vykonané pomocou štatistického softvéru Excel a SPSS verzie 23.0 pre deskriptívnu štatistiku. Analyzovala sa pozitívna, negatívna a celková percentuálna zhoda a na určenie stupňa zhody každej metódy s CRS bolo použité skóre Kappa. Hodnoty Kappa sa interpretujú nasledovne: 0,01 až 0,20 pre miernu zhodu, 0,21 až 0,40 pre všeobecnú zhodu, 0,41 – 0,60 pre strednú zhodu, 0,61 – 0,80 pre hlavnú zhodu a 0,81 – 0,99 pre úplnú zhodu28.
Etické schválenie bolo získané od Univerzity v Addis Abebe a všetky experimentálne protokoly pre túto štúdiu boli schválené Vedeckou etickou komisiou Etiópskeho inštitútu verejného zdravia. Referenčné číslo etickej licencie EPHI je EPHI/IRB-279-2020. Všetky metódy boli použité v súlade s odporúčaniami a ustanoveniami Etiópskych národných komplexných usmernení pre liečbu COVID-19. Okrem toho bol pred účasťou na štúdii získaný písomný informovaný súhlas od všetkých účastníkov štúdie.
Všetky údaje získané alebo analyzované v tejto štúdii sú zahrnuté v tomto publikovanom článku. Údaje podporujúce výsledky tejto štúdie sú k dispozícii od príslušného autora na základe odôvodnenej žiadosti.
Svetová zdravotnícka organizácia. Odporúčania pre stratégie laboratórneho testovania na COVID-19: Predbežné usmernenie, 21. marca 2020 č. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. a Gourgoulianis, KI Inteligentná diagnostika COVID-19 na pohotovosti: Všetko v praxi. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. a Gourgoulianis, KI Inteligentná diagnostika COVID-19 na pohotovosti: Všetko v praxi.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. a Gurgulianis, KI Inteligentná diagnostika COVID-19 na pohotovosti: všetko v praxi.Muliou DS, Pantazopoulos I. a Gurgulyanis KI Inteligentná diagnostika COVID-19 na pohotovostných oddeleniach: komplexná integrácia v praxi. Expert Reverend Respire. medicine. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL a St George, K. Hodnotenie testu COVID19 ID NOW EUA. Mitchell, SL a St George, K. Hodnotenie testu COVID19 ID NOW EUA.Mitchell, SL a St. George, K. Hodnotenie testu COVID19 ID NOW EUA.Mitchell SL a St. George K. Hodnotenie testu COVID19 ID NOW EUA. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. Laboratórna detekcia koronavírusového ochorenia 2019 (COVID-19) u ľudí s podozrením na ochorenie. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (prístup 15. augusta 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. a kol. Diagnóza COVID-19: Choroby a testovacie nástroje. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. a kol. Založenie Kolégia patológov východnej, strednej a južnej Afriky – Regionálnej školy patológie Blízkeho východu a Južnej Afriky. Afrika. J. Lab. medicine. 9(1), 1-8 (2020).
Etiópsky inštitút verejného zdravia, Federálne ministerstvo zdravotníctva. Predbežná národná stratégia a usmernenia pre laboratórnu diagnostiku COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (prístup 12. augusta 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. a Kesselheim, AS Falošne negatívne testy na infekciu SARS-CoV-2 a jej dôsledky. Woloshin, S., Patel, N. a Kesselheim, AS Falošne negatívne testy na infekciu SARS-CoV-2 a jej dôsledky.Voloshin S., Patel N. a Kesselheim AS Falošne negatívne testy na infekcie SARS-CoV-2 a ich dôsledky.Voloshin S., Patel N. a Kesselheim AS Falošne negatívne testy na provokáciu a vplyv infekcie SARS-CoV-2. N. eng. J. Medicine. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS a Gourgoulianis, KI Falošne pozitívne a falošne negatívne prípady COVID-19: Stratégie prevencie a liečby respiračného ochorenia, očkovanie a ďalšie perspektívy. Mouliou, DS a Gourgoulianis, KI Falošne pozitívne a falošne negatívne prípady COVID-19: Stratégie prevencie a liečby respiračného ochorenia, očkovanie a ďalšie perspektívy. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположительные a ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторнафипи стратегии лечения, вакцинация и дальнейшие перспективы. Mouliou, DS a Gourgoulianis, KI Falošne pozitívne a falošne negatívne prípady COVID-19: stratégie prevencie a liečby respiračného ochorenia, očkovanie a ďalší postup.Muliu, DS a Gurgulianis, KI Falošne pozitívne a falošne negatívne prípady COVID-19: stratégie pre prevenciu a liečbu respiračného systému, očkovanie a ďalší postup. Expert Reverend Respire. medicína. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. a Konstantinos, G. Diagnóza COVID-19 na pohotovosti: Vidieť strom, ale stratiť les. Mouliou, DS, Ioannis, P. a Konstantinos, G. Diagnóza COVID-19 na pohotovosti: Vidieť strom, ale stratiť les.Mouliou, DS, Ioannis, P. a Konstantinos, G. Diagnóza COVID-19 na pohotovosti: Vidieť strom, stratiť les.Muliou DS, Ioannis P. a Konstantinos G. Diagnóza COVID-19 na pohotovostiach: Nie je dosť lesa pre stromy. Appear. medicine. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. a kol. Validácia a validácia analytického a klinického výkonu testu Abbott RealTime SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. a Aflatoonian, B. Porovnanie piatich súborov primerov z rôznych oblastí genómu COVID-19 na detekciu vírusovej infekcie pomocou konvenčnej RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. a Aflatoonian, B. Porovnanie piatich súborov primerov z rôznych oblastí genómu COVID-19 na detekciu vírusovej infekcie pomocou konvenčnej RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. a Aflatunyan, B. Porovnanie piatich sád primérov z rôznych oblastí genómu COVID-19 na detekciu vírusovej infekcie pomocou konvenčnej RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. a Aflatoonian, B. Porovnanie 5 rôznych genetických oblastí COVID-19 na detekciu vírusovej infekcie pomocou konvenčnej RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. a Aflatunyan B. Porovnanie piatich sád primerov z rôznych oblastí genómu COVID-19 na detekciu vírusovej infekcie pomocou konvenčnej RT-PCR.Irán. Časopis mikrobiológie. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. a kol. Predbežné výsledky národného programu externého hodnotenia kvality pre detekciu genómových sekvencií SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. a kol. Analytické hodnotenie účinnosti piatich RT-PCR súprav pre závažný akútny respiračný syndróm koronavírusu 2. J. Clinical. laboratory. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. a kol. Hodnotenie siedmich komerčne dostupných súprav na detekciu RNA SARS-CoV-2 v Číne na základe polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) v reálnom čase. clinical. Chemical. laboratory. medicine. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB a kol. Porovnanie siedmich komerčných diagnostických súprav RT-PCR na COVID-19. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu a kol. Porovnanie diagnostického výkonu dvoch PCR súprav na detekciu nukleových kyselín SARS-CoV-2. J. Clinical. laboratory. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR atď. Porovnávacia štúdia štyroch platforiem na testovanie amplifikácie nukleových kyselín (NAAT) SARS-CoV-2 ukázala, že výkonnosť ID NOW bola významne znížená v závislosti od pacienta a typu vzorky. diagnóza. mikrobiológia. Infect. diss. 99(1), 115200 (2021).
Molekula Abbott. Príbalový leták k lieku Abbott pre analýzu SARS-CoV-2 v reálnom čase. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (K 10. augustu 2020) (2020).
Klein, S. a kol. Izolácia RNA SARS-CoV-2 pomocou magnetických guľôčok pre rýchlu detekciu vo veľkom meradle metódami RT-qPCR a RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).